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ELISA實驗出現(xiàn)“花板"現(xiàn)象大探秘 !
酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。該實驗因其靈敏度較高，特異性較好，操作較簡單，可大批量操作而廣泛應(yīng)用于多種傳染性疾病的篩查工作中。然而，“花板"現(xiàn)象的出現(xiàn)，往往會給實驗者判讀結(jié)果帶來麻煩。所謂“花板"，就是空白、陰性、陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的OD值卻偏高，弱陽性結(jié)果較多。筆者對“花板"現(xiàn)象進(jìn)行了分析和總結(jié)，認(rèn)為花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過程也會導(dǎo)致。
1、花板原因大多在樣品
所謂“花板"，就是空白、陰陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的OD值卻偏高。之所以空白、對照及質(zhì)控結(jié)果正常而標(biāo)本孔異常，是因為樣品本身的原因，大部分或全部標(biāo)本孔的OD值偏高，很可能是因為樣品中某些共有的物質(zhì)非特異性的吸附于固相載體，而在實驗的過程中未被除去。
1.1、 待測血清中混有紅細(xì)胞或纖維蛋白原 這兩種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，實驗表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000 /min)和較長的離心時間(>10 min)之下，血液標(biāo)本被充分地離心分離之后，使紅細(xì)胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時避免加入紅細(xì)胞和纖維蛋白，避免這兩種干擾物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響，就可避免“花板"情況。
1.2、 高IgG血癥 在實際工作中，檢測丙肝的實驗出現(xiàn)花板的情況較多，原因之一是因為目國內(nèi)外的抗-HCV EIA試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測原理，間接法的一個重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG，IgG對聚苯乙烯有較強(qiáng)的吸附力，非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽性。
2、解決辦法主要在洗滌
聚苯乙烯因其具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA實驗的固相載體，聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，因此需要通過洗滌清除在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻決定著實驗的成敗。上述提到的血清中存在紅細(xì)胞或纖維蛋白原，可以在加樣離心時得到控制，同樣也可以通過適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和浸泡時間減輕或避免對實驗結(jié)果的影響，同樣，對于血液存在的非特異性的IgG,實驗者很難在加樣時將其去除，那么解決的時機(jī)就是洗滌過程。
ELISA在洗滌過程中需注意以下幾點：
(1)、板要平整，尤其是在用洗板機(jī)洗板的過程中，往往是3排一起洗，如果板不平，就很可能造成洗液有殘留，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈，對實驗結(jié)果造成干擾。
(2)、洗液溫度，實驗表明，洗液溫度也會影響洗板的干凈程度，尤其是冬天溫度過低時容易出現(xiàn)“花板"問題。因此，保持室溫在20℃-30℃。
(3)、洗液要注滿孔，孔壁洗滌不干凈也易造成“花板"現(xiàn)象。
(4)、洗液要新鮮配置，洗液要臨用新鮮配制，放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或混濁，造成賭孔或花板。
(5)、洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時間過短也會造成由于洗板不凈而造成“花板"。
3、孵育時間過長也會造成“花板"
實驗室有一段時間經(jīng)常出現(xiàn)丙肝檢測“花板"現(xiàn)象，究其原因是由于樣本較多，加樣后未及時放入孵育箱，反應(yīng)板在室溫呆的時間過長，即間接增加了孵育時間，導(dǎo)致孵育時間過長，蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體。因此，應(yīng)嚴(yán)格控制加樣時間，加樣后及時孵育，標(biāo)本較多時可分批操作。
此外，有些廠家的試劑顯色液不穩(wěn)定，使用容易變藍(lán)，如在實驗不仔細(xì)檢查，很容易導(dǎo)致“花板"現(xiàn)象的發(fā)生，這也提醒實驗者應(yīng)使用新鮮的顯色液，程度的實驗的準(zhǔn)確性。
綜上所述，將ELISA“花板"現(xiàn)象總結(jié)為：花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過程也會導(dǎo)致。既然原因大多在樣品，那么在樣品交接時應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定，無溶血，無凝血，足量，單個的溶血樣品雖不致造成“花板"，但血紅蛋白中的血紅素基團(tuán)，具有類過氧化物的活性，在以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為標(biāo)記酶的ELISA測定中，易在孵育過程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色，從而造成假陽性。洗滌是ELISA的關(guān)鍵步驟，充分有效的洗滌也是避免“花板"的有利措施。同樣，嚴(yán)格按照試劑說明孵育，使用新鮮的顯色液也是有效避免“花板"的保障。以上措施可以有效減少“花板"次數(shù)，從而提高檢測的特異性和準(zhǔn)確性，更好的發(fā)揮ELISA的方法學(xué)優(yōu)勢。
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